特定の遺伝子を削除するために当初開発された遺伝子編集システムを用い、MITの研究者らは今回、生きた細胞内で任意に選んだ遺伝子を確実にオンにできることを示した。
このCRISPR/Cas9遺伝子編集システムの新たな応用により、個々の遺伝子の機能をより容易に特定できるようになるはずだと、MITの脳・認知科学部および生物工学部のW.M.ケック・キャリア開発教授であり、ブロード研究所およびMITマクガバン脳研究所のメンバーでもあるFeng Zhangは述べている。
このアプローチは、ゲノム全体を対象とした迅速な機能スクリーニングも可能にし、特定の疾患に関与する遺伝子を研究者が特定できるようにする。Natureの12月10日付オンライン版に掲載された研究で、Zhangらは、メラノーマ細胞が抗がん剤に耐性を持つようになるのを助ける複数の遺伝子を特定した。
Zhangの研究室の大学院生Silvana Konermannと、マクガバン研究所の博士研究員Mark Brighamが、この論文の筆頭著者である。
CRISPRの新たな機能
CRISPRシステムは、細菌がウイルス感染から身を守るために使う細胞機構を利用している。研究者らは以前、この細胞システムを応用し、Cas9と呼ばれるDNA切断酵素に、特定のゲノム配列に結合するようプログラムされた短いRNAガイド鎖を結合させた遺伝子編集複合体を作製した。これにより、Cas9がどこを切断するかが指定される。
過去2年間に、科学者らは遺伝子をオフにしたり、別の型に置き換えたりするツールとしてCas9を開発してきた。今回の研究では、Zhangらは遺伝子をノックアウトするのではなく、オンにするようCas9システムを改変した。
科学者らはこれまでにも、特定の部位のDNAを標的とするよう個別に設計したタンパク質を使って、これを試みてきた。しかし、こうしたタンパク質は扱いが難しい。「旧世代のツールを使う場合、技術に実際に望む動作をさせること自体が、それだけで一つのプロジェクトになります」とKonermannは言う。「時間がかかるうえ、かなり費用もかかります。」
Cas9酵素のDNAを切断する部分を不活性化し、Cas9を活性化ドメインと呼ばれるタンパク質断片に結合させることで、CRISPRを使って遺伝子をオンにしようとする試みもあった。これらのドメインは、DNAからRNAを読み取り、複製し始めるのに必要な細胞機構を呼び寄せる。この過程は転写として知られる。
しかし、こうした試みでは遺伝子の転写を安定してオンにすることができなかった。Zhangと、東京大学のOsamu NurekiおよびHiroshi Nishimasuは、Cas9がガイドRNAと標的DNAに結合したときに形成される構造について、 今年初めに発表した 解析に基づき、CRISPR-Cas9システムを抜本的に見直すことにした。「その3次元形状が分かれば、システムを合理的にどう改善できるか考えられます」とZhangは言う。
これまでの試みでは、科学者らは活性化ドメインをCas9タンパク質の両端いずれかに結合させようとしていたが、成功は限られていた。構造研究を通じて、MITのチームは、RNAガイドの小さなループが2つCas9複合体から突き出ており、転写機構を呼び寄せる際に活性化ドメインにより大きな柔軟性を持たせられるため、より適した結合部位になり得ると気づいた。
改良したシステムを使い、研究者らは、従来世代のCas9活性化因子ではオンにするのが困難、あるいは不可能だった約12個の遺伝子を活性化した。各遺伝子で転写が少なくとも2倍に増加し、多くの遺伝子では、活性化が複数の桁にわたって増加することが確認された。
ゲノム規模の活性化スクリーニング
このシステムが遺伝子の活性化に有効であることを示した後、研究者らは、ヒトゲノムにある2万を超えるすべての遺伝子を標的とする70,290本のガイドRNAライブラリーを作製した。
このライブラリーをスクリーニングし、PLX-4720というメラノーマ治療薬への耐性をもたらす遺伝子を特定した。この種の薬剤は、メラノーマ細胞にBRAF遺伝子の変異がある患者にはよく効くが、治療を生き延びたがん細胞は新たな腫瘍へと成長し、がんが再発することがある。
細胞が耐性を持つのを助ける遺伝子を見つけるため、研究者らは研究室で培養した多数のメラノーマ細胞にCRISPRの構成要素を導入した。各細胞には、異なる遺伝子を標的とする別々のガイドRNAが一つずつ導入された。細胞をPLX-4720で処理した後、細胞の生存を助けた複数の遺伝子を特定した。その中には薬剤耐性への関与がすでに知られていた遺伝子のほか、新たな標的もいくつか含まれていた。
このような研究は、腫瘍が耐性を持つのを防ぐ新たながん治療薬の発見に役立つ可能性がある。
「変異したBRAFを標的とする薬剤に、細胞の生存を可能にする遺伝子を標的とする併用療法を組み合わせて始めることができます。両方を同時に標的にすれば、薬剤治療にもかかわらず増殖を続けられる耐性機構を細胞が発達させるのを、おそらく防げるでしょう」とKonermannは言う。
科学者らは、ウイルスに載せた単一の遺伝子を導入することで、このような大規模スクリーニングを試みてきたが、すべての遺伝子でうまくいくわけではない。
「この新しい手法なら、役割を果たしている可能性のある、より幅広い遺伝子群を調べられるでしょう」と、研究には参加していないダナ・ファーバーがん研究所の医学准教授Levi Garrawayは言う。「これはまさに技術開発に関する論文ですが、薬剤耐性スクリーニングの興味深い結果は、このアプローチが持つ豊かな生物学的可能性を示しています。」
Zhangの研究室はこの手法を使い、活性化すると自閉症やアルツハイマー病などの神経変性疾患の影響を修正できる遺伝子のスクリーニングも計画している。また、利用を希望する大学の研究室に必要な試薬を、Addgeneのリポジトリを通じて提供する計画だ。
この研究は、米国国立精神衛生研究所、米国国立神経疾患・脳卒中研究所、Keck、Searle Scholars、Klingenstein、Vallee、Simonsの各財団、およびBob Metcalfeの資金援助を受けた。
本記事は、 MIT Newsとの協力により掲載されています。掲載は、世界経済フォーラムによる見解への賛同を意味するものではありません。
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著者：Anne TraftonはMIT Newsの寄稿者です。
画像：2011年5月23日、ミュンヘンの研究所で保管されているヒトの遺伝物質。REUTERS/Michael Dalder。